TIANSeq mRNA பிடிப்பு கிட்

தற்போது, ​​உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை தொழில்நுட்பம் முக்கியமாக அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டது. அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை தொழில்நுட்பத்தின் வாசிப்பு நீளம் குறைவாக இருப்பதால், நாம் முழு நீள வரிசையை வரிசைக்கு சிறிய துண்டு நூலகங்களாக உடைக்க வேண்டும். வெவ்வேறு வரிசைமுறை சோதனைகளின் தேவைகளுக்கு ஏற்ப, நாங்கள் பொதுவாக ஒற்றை-முனை வரிசைமுறை அல்லது இரட்டை முனை வரிசைமுறையை தேர்வு செய்கிறோம். தற்போது அடுத்த தலைமுறை வரிசை நூலகத்தின் டிஎன்ஏ துண்டுகள் பொதுவாக 200-800 பிபி வரம்பில் விநியோகிக்கப்படுகின்றன.

அ) டிஎன்ஏ தரத்தில் மோசமானது மற்றும் தடுப்பான்களைக் கொண்டுள்ளது. என்சைம் செயல்பாட்டைத் தடுக்க உயர்தர டிஎன்ஏ மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தவும்.

ஆ) டிஎன்ஏ நூலகத்தை உருவாக்க பிசிஆர் இல்லாத முறையைப் பயன்படுத்தும் போது டிஎன்ஏ மாதிரியின் அளவு போதுமானதாக இல்லை. துண்டு துண்டான டிஎன்ஏவின் உள்ளீடு 50 என்ஜிக்கு மேல் இருக்கும்போது, ​​பிசிஆர் இல்லாத பணிப்பாய்வு நூலக கட்டுமான செயல்பாட்டின் போது தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் மேற்கொள்ளப்படும். நூலகத்தின் நகல் எண் நேரடியாக வரிசைப்படுத்த முடியாத அளவுக்கு குறைவாக இருந்தால், அடாப்டர் இணைப்புக்குப் பிறகு டிஎன்ஏ நூலகத்தை பிசிஆர் மூலம் பெருக்கலாம்.

c) RNA மாசுபாடு தவறான ஆரம்ப டிஎன்ஏ அளவீட்டுக்கு வழிவகுக்கிறது மரபணு டிஎன்ஏவின் சுத்திகரிப்பு செயல்பாட்டில் ஆர்என்ஏ மாசுபாடு இருக்கலாம், இது தவறான டிஎன்ஏ அளவு மற்றும் நூலக கட்டுமானத்தின் போது போதிய டிஎன்ஏ ஏற்றுவதற்கு வழிவகுக்கலாம். RNase உடன் சிகிச்சையளிப்பதன் மூலம் RNA ஐ அகற்றலாம்.

ஏ -1

a) சிறிய துண்டுகள் (60 bp-120 bp) தோன்றுகிறது சிறிய துண்டுகள் அடாப்டர்களால் உருவாக்கப்பட்ட அடாப்டர் துண்டுகள் அல்லது டைமர்கள். Agencourt AMPure XP காந்த மணிகளுடன் சுத்திகரிப்பு இந்த அடாப்டர் துண்டுகளை திறம்பட அகற்றி, வரிசை தரத்தை உறுதி செய்யும்.

ஆ) பிசிஆர் பெருக்கத்திற்குப் பிறகு நூலகத்தில் பெரிய துண்டுகள் தோன்றும் அடாப்டர் பிணைப்புக்குப் பிறகு டிஎன்ஏ துண்டு 120 பிபிக்கு மேல் அதிகரித்தால், அது அதிகப்படியான பிசிஆர் பெருக்கத்தின் அசாதாரண துண்டு பெருக்கம் காரணமாக இருக்கலாம். PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறைப்பதன் மூலம் நிலைமையை தடுக்கலாம்.

இ) அடாப்டர் பிணைப்புக்குப் பிறகு நூலக டிஎன்ஏ துண்டுகளின் அசாதாரண அளவு இந்த கிட்டில் உள்ள அடாப்டரின் நீளம் 60 பிபி ஆகும். துண்டின் இரண்டு முனைகளும் அடாப்டர்களுடன் இணைக்கப்படும்போது, ​​நீளம் 120 bp மட்டுமே அதிகரிக்கும். இந்த கிட் வழங்கியதைத் தவிர அடாப்டரைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​அடாப்டர் நீளம் போன்ற பொருத்தமான தகவலை வழங்க சப்ளையரைத் தொடர்பு கொள்ளவும். கையேட்டில் விவரிக்கப்பட்டுள்ள வழிமுறைகளை சோதனை பணிப்பாய்வு மற்றும் செயல்பாட்டைப் பின்பற்றுகிறதா என்பதை உறுதிப்படுத்தவும்.

ஈ) அடாப்டர் பிணைப்புக்கு முன் அசாதாரண டிஎன்ஏ துண்டு அளவு டிஎன்ஏ துண்டு துண்டாகும்போது தவறான எதிர்வினை நிலைகளால் இந்த பிரச்சனைக்கான காரணம் ஏற்படலாம். வெவ்வேறு டிஎன்ஏ உள்ளீடுகளுக்கு வெவ்வேறு எதிர்வினை நேரங்கள் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும். டிஎன்ஏ உள்ளீடு 10 என்ஜிக்கு மேல் இருந்தால், 12 நிமிட எதிர்வினை நேரத்தை தேர்வுமுறைக்கான தொடக்க நேரமாக தேர்வு செய்ய பரிந்துரைக்கிறோம், மேலும் இந்த நேரத்தில் உற்பத்தி செய்யப்படும் துண்டு அளவு முக்கியமாக 300-500 பிபி வரம்பில் இருக்கும். டிஎன்ஏ துண்டுகளை தேவையான அளவுடன் மேம்படுத்த பயனர்கள் தங்கள் சொந்த தேவைகளுக்கு ஏற்ப டிஎன்ஏ துண்டுகளின் நீளத்தை 2-4 நிமிடங்களுக்கு அதிகரிக்கவோ குறைக்கவோ முடியும்.

A-2

அ) துண்டு துண்டான நேரம் உகந்ததாக இல்லை என்றால் துண்டு துண்டான டிஎன்ஏ மிகச் சிறியதாகவோ அல்லது மிகப் பெரியதாகவோ இருந்தால், தயவுசெய்து எதிர்வினை நேரத்தைத் தீர்மானிக்க அறிவுறுத்தலில் வழங்கப்பட்ட துண்டு துண்டான நேரத் தேர்வுக்கான வழிகாட்டுதல்களைப் பார்க்கவும், மேலும் இந்த நேர புள்ளியை ஒரு கட்டுப்பாடாகப் பயன்படுத்தவும், கூடுதலாக அமைக்க துண்டு துண்டான நேரத்தில் துல்லியமாக சரிசெய்ய 3 நிமிடங்களை நீட்டிக்க அல்லது குறைக்க எதிர்வினை அமைப்பு.

A-3

துண்டு துண்டான சிகிச்சையின் பின்னர் டிஎன்ஏவின் அசாதாரண அளவு விநியோகம்

அ) துண்டு துண்டாக்கும் கருவியின் தவறான கரைக்கும் முறை, அல்லது உறைந்த பிறகு உலை முழுமையாக கலக்கப்படவில்லை. 5 × ஃப்ராக்மென்டேஷன் என்சைம் கலவையை பனியில் கரைக்கவும். கரைந்தவுடன், குழாயின் அடிப்பகுதியை மெதுவாக அசைப்பதன் மூலம் உலைகளை சமமாக கலக்கவும். வினைப்பொருளை சுழற்ற வேண்டாம்!

ஆ) டிஎன்ஏ உள்ளீட்டு மாதிரியில் எடிடிஏ அல்லது பிற மாசுபடுத்திகள் உப்பு அயனிகள் குறைதல் மற்றும் டிஎன்ஏ சுத்திகரிப்பு படிநிலையில் உள்ள செலேட்டிங் முகவர்கள் சோதனையின் வெற்றிக்கு மிகவும் முக்கியமானது. டிஎன்ஏ 1 × டிஇயில் கரைக்கப்பட்டால், துண்டு துண்டாகச் செய்ய அறிவுறுத்தலில் வழங்கப்பட்ட முறையைப் பயன்படுத்தவும். கரைசலில் உள்ள EDTA செறிவு நிச்சயமற்றதாக இருந்தால், டிஎன்ஏவை சுத்திகரிக்கவும் மற்றும் அடுத்தடுத்த எதிர்வினைக்கு டீயோனைஸ் செய்யப்பட்ட நீரில் கரைக்கவும் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

c) துல்லியமற்ற ஆரம்ப டிஎன்ஏ அளவீடு துண்டு துண்டான டிஎன்ஏவின் அளவு டிஎன்ஏ உள்ளீட்டின் அளவோடு நெருக்கமாக தொடர்புடையது. துண்டு துண்டான சிகிச்சைக்கு முன், குபிட், பிகோகிரீன் மற்றும் பிற முறைகளைப் பயன்படுத்தி டிஎன்ஏவின் துல்லியமான அளவீடு எதிர்வினை அமைப்பில் டிஎன்ஏவின் சரியான அளவைத் தீர்மானிக்க அவசியம்.

 d) எதிர்வினை அமைப்பைத் தயாரிப்பது அறிவுறுத்தலைப் பின்பற்றுவதில்லை. சிறந்த விளைவை உறுதிப்படுத்த, அனைத்து எதிர்வினை கூறுகளும் பனியில் வைக்கப்பட வேண்டும் மற்றும் முழுமையான குளிரூட்டலுக்குப் பிறகு எதிர்வினை அமைப்பைத் தயாரிக்க வேண்டும். தயாரிப்பு முடிந்ததும், தயவுசெய்து ஃப்ளிக்க் அல்லது பைபெட்டை நன்கு கலக்கவும். சுழல் வேண்டாம்!

1. முறையற்ற கலவை முறை (சுழல், வன்முறை அலைவு, முதலியன) நூலகத் துண்டுகளின் அசாதாரண விநியோகத்தை ஏற்படுத்தும் (பின்வரும் படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி), இதனால் நூலகத்தின் தரத்தை பாதிக்கும். எனவே, ஃப்ராக்மென்டேஷன் மிக்ஸ் ரியாக்ஷன் கரைசலைத் தயாரிக்கும் போது, ​​தயவுசெய்து மேல் மற்றும் கீழ் குழல்களைக் கலக்கவும், அல்லது விரல் நுனியைப் பயன்படுத்தி சமமாக கலக்கவும். சுழலில் கலக்காமல் கவனமாக இருங்கள்.

2. நூலக கட்டுமானத்திற்கு உயர் தூய்மை டிஎன்ஏ பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்

DNA நல்ல டிஎன்ஏ ஒருமைப்பாடு: எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் பேண்ட் 30 கேபிக்கு மேல், வால் இல்லாமல்

D OD260/230:> 1.5

D OD260/280: 1.7-1.9

3. டிஎன்ஏ உள்ளீட்டு அளவு துல்லியமாக இருக்க வேண்டும் நானோ டிராப்பை விட டிஎன்ஏவை அளவிட குபிட் மற்றும் பிகோகிரீன் முறைகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

4. டிஎன்ஏ கரைசலில் உள்ள எடிடிஏவின் உள்ளடக்கம் உறுதியாக இருக்க வேண்டும், இடிடிஏ துண்டு துண்டாக்கும் வினையில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. EDTA இன் உள்ளடக்கம் அதிகமாக இருந்தால், அடுத்தடுத்த சோதனைக்கு முன் DNA சுத்திகரிப்பு செய்யப்பட வேண்டும்.

5. துண்டு துண்டான எதிர்வினை தீர்வு பனியில் தயாரிக்கப்பட வேண்டும். துண்டு துண்டாக்கும் செயல்முறை எதிர்வினை வெப்பநிலை மற்றும் நேரத்திற்கு உணர்திறன் கொண்டது (குறிப்பாக மேம்படுத்தியைச் சேர்த்த பிறகு). எதிர்வினை நேரத்தின் துல்லியத்தை உறுதி செய்ய, தயவுசெய்து பனியில் எதிர்வினை அமைப்பை தயார் செய்யவும்.

6. துண்டு துண்டான எதிர்வினை நேரம் துல்லியமாக இருக்க வேண்டும்.

1. இந்த கருவிக்கு என்ன மாதிரியான மாதிரி பொருந்தும்?

இந்த கிட்டின் பொருந்தக்கூடிய மாதிரி வகை மொத்த ஆர்என்ஏ அல்லது நல்ல ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாடு கொண்ட சுத்திகரிக்கப்பட்ட எம்ஆர்என்ஏவாக இருக்கலாம். நூலகத்தை உருவாக்க மொத்த ஆர்என்ஏ பயன்படுத்தப்பட்டால், முதலில் ஆர்ஆர்என்ஏவை அகற்ற ஆர்ஆர்என்ஏ குறைப்பு கருவியை (கேட்#4992363/4992364/4992391) பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

2. இந்த கிட் மூலம் நூலகத்தை உருவாக்க FFPE மாதிரிகள் பயன்படுத்த முடியுமா?

FFPE மாதிரிகளில் உள்ள mRNA ஓரளவிற்கு சீரழிந்து, ஒப்பீட்டளவில் மோசமான ஒருமைப்பாடுடன் இருக்கும். நூலக கட்டுமானத்திற்கு இந்த கருவியைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​துண்டு துண்டாகும் நேரத்தை மேம்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது (துண்டு துண்டாகும் நேரத்தை குறைக்க அல்லது துண்டு துண்டாக செய்யாமல்).

3. தயாரிப்பு கையேட்டில் வழங்கப்பட்ட அளவு தேர்வு படிநிலையைப் பயன்படுத்தி, செருகப்பட்ட பிரிவு சிறிதளவு விலகல் தோன்றுவதற்கு என்ன காரணம்?

இந்த தயாரிப்பு கையேட்டில் அளவு தேர்வு படி கண்டிப்பாக அளவு தேர்வு மேற்கொள்ளப்பட வேண்டும். விலகல் இருந்தால், காரணம் காந்த மணிகள் அறை வெப்பநிலையுடன் சமநிலையில் இல்லை அல்லது முழுமையாக கலக்கப்படவில்லை, குழாய் துல்லியமாக இல்லை அல்லது திரவம் நுனியில் இருக்கும். சோதனைக்கு குறைந்த உறிஞ்சலுடன் உதவிக்குறிப்புகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

4. நூலக கட்டுமானத்தில் அடாப்டர்களின் தேர்வு

நூலக கட்டுமான கருவி அடாப்டர் ரீஜென்ட் இல்லை, மேலும் இந்த கிட்டை TIANSeq ஒற்றை-குறியீட்டு அடாப்டர் (இல்லுமினா) (4992641/4992642/4992378) உடன் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.

5. நூலகத்தின் QC

நூலக அளவீடு கண்டறிதல்: குபிட் மற்றும் qPCR ஆகியவை முறையே நூலகத்தின் வெகுஜன செறிவு மற்றும் மோலார் செறிவை தீர்மானிக்கப் பயன்படுகிறது. தயாரிப்பு கையேடுக்கு ஏற்ப கண்டிப்பாக செயல்படுகிறது. நூலகத்தின் செறிவு பொதுவாக NGS வரிசைப்படுத்தலின் தேவைகளைப் பூர்த்தி செய்யும். நூலக விநியோக வரம்பைக் கண்டறிதல்: நூலக விநியோக வரம்பைக் கண்டறிய அஜிலண்ட் 2100 பயோஅனலைசரைப் பயன்படுத்துதல்.

6. பெருக்க சுழற்சி எண்ணின் தேர்வு

அறிவுறுத்தல்களின்படி, PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை 6-12 ஆகும், மேலும் மாதிரி உள்ளீட்டின் படி தேவையான PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை தேர்ந்தெடுக்கப்பட வேண்டும். அதிக மகசூல் கொண்ட நூலகங்களில், பெருக்கம் பொதுவாக பல்வேறு அளவுகளில் நிகழ்கிறது, இது சுறுசுறுப்பான 2100 பயோஅனலைசர் கண்டறிதலில் இலக்கு வரம்பின் உச்சத்திற்குப் பிறகு சற்றே பெரிய உச்சநிலையால் வெளிப்படுகிறது, அல்லது குபிட்டின் கண்டறியப்பட்ட செறிவு qPCR ஐ விட குறைவாக உள்ளது. லேசான பெருக்கம் என்பது ஒரு சாதாரண நிகழ்வு, இது நூலக வரிசைமுறை மற்றும் அடுத்தடுத்த தரவு பகுப்பாய்வை பாதிக்காது.

7. அஜிலண்ட் 2100 பயோஅனலைசரின் கண்டறிதல் சுயவிவரத்தில் கூர்முனை தோன்றும்

அஜிலண்ட் 2100 பயோஅனலைசர் கண்டறிதலில் கூர்முனை தோன்றுவது மாதிரிகளின் சீரற்ற துண்டு துண்டின் காரணமாகும், அங்கு குறிப்பிட்ட அளவில் அதிக துண்டுகள் இருக்கும், மேலும் இது பிசிஆர் செறிவூட்டலுக்குப் பிறகு தெளிவாகத் தெரியும். இந்த விஷயத்தில், அளவு தேர்வைச் செய்ய வேண்டாம் என்று பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, அதாவது துண்டு துண்டான நிலையை 94 ° C ஆக 15 நிமிடம் அடைகாக்கவும், அங்கு துண்டு விநியோகம் சிறியது மற்றும் குவிந்துள்ளது, மேலும் ஒருமைப்பாட்டை மேம்படுத்தலாம்.