குவாண்ட்ஸ்கிரிப்ட் ஆர்டி கிட்

A-1 RNA சீரழிந்துள்ளது

—— மாசு இல்லாமல் உயர்தர RNA ஐ சுத்திகரிக்கவும். ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பொருள் ஆர்என்ஏ சீரழிவைத் தடுக்க முடிந்தவரை புதியதாக இருக்க வேண்டும். ஆர்டி எதிர்வினைக்கு முன் மறுக்கப்பட்ட ஜெல் மீது ஆர்என்ஏ ஒருமைப்பாட்டை பகுப்பாய்வு செய்யவும். ஆர்என்ஏ பிரித்தெடுத்த பிறகு, அதை 100% ஃபார்மமைட்டில் சேமிக்க வேண்டும். RNase தடுப்பானைப் பயன்படுத்தினால், வெப்ப வெப்பநிலை <45 ° C ஆக இருக்க வேண்டும், மற்றும் pH 8.0 க்கும் குறைவாக இருக்க வேண்டும், இல்லையெனில் தடுப்பானானது அனைத்து பிணைக்கப்பட்ட RNase ஐ வெளியிடும். மேலும், RNase தடுப்பானை solutions 0.8 mM DTT கொண்ட தீர்வுகளில் சேர்க்க வேண்டும்.

A-2 RNA தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் எதிர்வினைகளின் தடுப்பான்களைக் கொண்டுள்ளது

——Rversse டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இன்ஹிபிட்டர்களில் SDS, EDTA, கிளிசரால், சோடியம் பைரோபாஸ்பேட், ஸ்பெர்மைடின், ஃபார்மைட், குவானிடின் உப்பு போன்றவை அடங்கும். தடுப்பான்களை அகற்ற RNA மழைப்பொழிவை 70% (v/v) எத்தனால் கொண்டு கழுவவும்.

சிடிஎன்ஏவின் முதல் இழையை ஒருங்கிணைக்கப் பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்களின் ஏ -3 போதிய அனீலிங்

—— சோதனையில் பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்களுக்கு அனீலிங் வெப்பநிலை பொருத்தமானது என்பதை தீர்மானிக்கவும். சீரற்ற ஹெக்ஸாமர்களுக்கு, எதிர்வினை வெப்பநிலையை அடைவதற்கு முன்பு 10 நிமிடங்களுக்கு 25 ° C வெப்பநிலையை வைத்திருக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது. மரபணு சார்ந்த ப்ரைமர்களுக்கு (ஜிஎஸ்பி), மற்ற ஜிஎஸ்பியை முயற்சிக்கவும் அல்லது ஒலிகோ (டிடி) அல்லது சீரற்ற ஹெக்ஸாமருக்கு மாறவும்.

A-4 ஆரம்ப RNA இன் சிறிய அளவு

—— ஆர்என்ஏ அளவை அதிகரிக்கவும். 50 ng க்கும் குறைவான RNA மாதிரிகளுக்கு, 0.1 μg முதல் 0.5 μg அசிடைல் BSA ஐ முதல் ஸ்ட்ராண்ட் cDNA தொகுப்பில் பயன்படுத்தலாம்

A-5 இலக்கு வரிசை பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்ட திசுக்களில் வெளிப்படுத்தப்படவில்லை.

—— மற்ற திசுக்களை முயற்சிக்கவும்.

A-6 PCR எதிர்வினை தோல்வியடைகிறது

—— இரண்டு-படி RT-PCR க்கு, PCR படியில் உள்ள cDNA டெம்ப்ளேட் எதிர்வினை அளவின் 1/5 ஐ தாண்டக்கூடாது.

A-1 ப்ரைமர்கள் மற்றும் டெம்ப்ளேட்களின் குறிப்பிட்ட அல்லாத அனீலிங்

ப்ரைமர்களின் 3'- முடிவில் 2-3 டிஜி அல்லது டிசி இருக்கக்கூடாது. சீரற்ற ப்ரைமர்கள் அல்லது ஒலிகோ (டிடி) க்கு பதிலாக முதல் ஸ்ட்ராண்ட் தொகுப்பில் மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களைப் பயன்படுத்தவும். முதல் சில சுழற்சிகளில் அதிக அனீலிங் வெப்பநிலையைப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் குறைந்த அனீலிங் வெப்பநிலையைப் பயன்படுத்தவும். எதிர்வினையின் குறிப்பிட்ட தன்மையை மேம்படுத்த பிசிஆருக்கு ஹாட்-ஸ்டார்ட் டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸைப் பயன்படுத்தவும்.

A-2 மரபணு சார்ந்த ப்ரைமர்களின் மோசமான வடிவமைப்பு

—— பெருக்கி ப்ரைமர் வடிவமைப்பிற்கான அதே கொள்கைகளைப் பின்பற்றவும்.

A-3 RNA மரபணு டி.என்.ஏ

—— PCR- தர DNase I உடன் RNA- க்கு சிகிச்சை அளிக்கவும். DNA மாசுபாட்டைக் கண்டறிய தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் இல்லாமல் ஒரு கட்டுப்பாட்டு எதிர்வினையை அமைக்கவும்.

ப்ரைமர் டைமரின் A-4 உருவாக்கம்

—— 3 'முடிவில் நிரப்பு வரிசைகள் இல்லாமல் ப்ரைமர்களை வடிவமைக்கவும்.

A-5 மிக அதிக Mg²⁺ செறிவு

—— Mg ஐ மேம்படுத்துங்கள்²⁺ ஒவ்வொரு டெம்ப்ளேட் மற்றும் ப்ரைமர் கலவையின் செறிவு

A-6 வெளிநாட்டு டி.என்.ஏ

ஏரோசோல் எதிர்ப்பு குறிப்புகள் மற்றும் யுடிஜி என்சைம்களைப் பயன்படுத்தவும்.

A-1 முதல் ஸ்ட்ராண்ட் தயாரிப்பின் உள்ளடக்கம் மிக அதிகம்

—— வழக்கமான PCR எதிர்வினை படியில் முதல் ஸ்ட்ராண்ட் தயாரிப்பின் அளவைக் குறைக்கவும்.

PCR எதிர்வினையில் A-2 மிக அதிக ப்ரைமர் அளவு

--- ப்ரைமர் உள்ளீட்டை குறைக்கவும்.

A-3 பல சுழற்சிகள்

—— PCR எதிர்வினை நிலைமைகளை மேம்படுத்துதல் மற்றும் PCR சுழற்சி எண்ணைக் குறைத்தல்.

A-4 மிகக் குறைவான அனீலிங் வெப்பநிலை

—— குறிப்பிடப்படாத துவக்கம் மற்றும் நீட்டிப்பைத் தடுக்க அனீலிங் வெப்பநிலையை அதிகரிக்கவும்.

ஏ -5 டிஎன்ஏவின் டிஎன்ஏஸ் சிதைவால் உருவாக்கப்பட்ட ஒலிகோநியூக்ளியோடைடு துண்டுகளின் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கம்-டிஎன்ஏ மாசுபடுவதைத் தடுக்க உயர்தர ஆர்என்ஏவை பிரித்தெடுக்கவும்.

ஆர்டி-பிசிஆர் என்பது ஆர்என்ஏவை சிடிஎன்ஏவாக மாற்றியமைப்பதாகும், பின்னர் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செய்யப்பட்ட சிடிஎன்ஏவை இலக்குத் துண்டைப் பெருக்க பிசிஆர் எதிர்வினைக்கான ஒரு டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்தவும். சோதனையின் குறிப்பிட்ட நிபந்தனைகளுக்கு ஏற்ப சீரற்ற ப்ரைமர்கள், ஒலிகோ டிடி மற்றும் மரபணு குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களை தேர்வு செய்யவும். மேலே உள்ள அனைத்து ப்ரைமர்களும் ஹேர்பின் அமைப்பு இல்லாமல் குறுகிய யூகாரியோடிக் செல் எம்ஆர்என்ஏவுக்குப் பயன்படுத்தப்படலாம்.

ரேண்டம் ப்ரைமர்: ஹேர்பின் கட்டமைப்பைக் கொண்ட நீண்ட ஆர்என்ஏ, அத்துடன் ஆர்ஆர்என்ஏ, எம்ஆர்என்ஏ, டிஆர்என்ஏ போன்ற அனைத்து வகையான ஆர்என்ஏவிற்கும் ஏற்றது, அவை முக்கியமாக ஒற்றை டெம்ப்ளேட்டின் ஆர்டி-பிசிஆர் எதிர்வினைக்குப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.

ஒலிகோ டிடி: பாலிஏ டெய்லிங் கொண்ட ஆர்என்ஏவுக்கு ஏற்றது (புரோகாரியோடிக் ஆர்என்ஏ, யூகாரியோடிக் ஒலிகோ டிடி ஆர்ஆர்என்ஏ மற்றும் டிஆர்என்ஏவுக்கு பாலிஆ வால்கள் இல்லை). ஒலிகோ டிடி பாலிஏ வாலுடன் பிணைக்கப்பட்டிருப்பதால், ஆர்என்ஏ மாதிரிகளின் தரம் அதிகமாக இருக்க வேண்டும், மேலும் ஒரு சிறிய அளவு சீரழிவு கூட முழு நீள சிடிஎன்ஏ தொகுப்பின் அளவை வெகுவாகக் குறைக்கும்.

மரபணு சார்ந்த ப்ரைமர்: டெம்ப்ளேட் வரிசைக்கு நிரப்பு, இலக்கு வரிசை அறியப்பட்ட சூழ்நிலைகளுக்கு ஏற்றது.

இரண்டு வழிகள் உள்ளன:

1. உள் குறிப்பு முறை: கோட்பாட்டில், சிடிஎன்ஏ என்பது வெவ்வேறு நீளங்களின் டிஎன்ஏ துண்டுகள், எனவே எலக்ட்ரோபோரேசிஸின் விளைவு ஸ்மியர் ஆகும். ஆர்என்ஏ மிகுதியாக இருந்தால், எலக்ட்ரோபோரேசிஸில் எந்த தயாரிப்பும் காட்டப்படாது, ஆனால் இது பிசிஆர் மூலம் எந்த தயாரிப்பும் பெருக்கப்படாது என்று அர்த்தமல்ல. பொதுவாக, சிடிஎன்ஏவைக் கண்டறிய உள் குறிப்பு பயன்படுத்தப்படலாம். உள் குறிப்பு முடிவுகளைக் கொண்டிருந்தால், சிடிஎன்ஏவின் தரம் அடிப்படையில் உத்தரவாதம் அளிக்கப்படலாம் (சில சந்தர்ப்பங்களில், இலக்கு மரபணு துண்டு மிக நீளமாக இருந்தால், விதிவிலக்குகள் இருக்கலாம்).

2. இந்த டெம்ப்ளேட் மூலம் அறியப்பட்ட மரபணு இருந்தால், இந்த மரபணுவின் ப்ரைமர்களால் சரிபார்க்க முடியும். உள் குறிப்பின் பெருக்கம் சிடிஎன்ஏவுடன் எந்த பிரச்சனையும் இல்லை என்று அர்த்தமல்ல. சிடிஎன்ஏவில் உள் குறிப்பு அதிக அளவில் இருப்பதால், அதை பெருக்குவது எளிது. சிடிஎன்ஏ பல்வேறு காரணங்களுக்காக ஓரளவு சீரழிந்தால், நிகழ்தகவு கண்ணோட்டத்தில், குறைந்த அளவு இலக்கு மரபணுக்களின் பிசிஆர் முடிவுகள் பெரிதும் பாதிக்கப்படும். உள் குறிப்பு இன்னும் அதிகமாக இருந்தாலும், பெருக்கம் பாதிக்கப்படாது.

ஆர்என்ஏவின் ஓரளவு சீரழிவு. RNA இன் ஒருமைப்பாட்டைக் கண்டறிந்து சுத்திகரிக்கவும்

வெவ்வேறு இனங்களின் ஆர்என்ஏ உள்ளடக்கங்கள் வேறுபட்டிருக்கலாம், ஆனால் பொதுவாக, பிரித்தெடுக்கப்பட்ட மொத்த ஆர்என்ஏ ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸில் இரண்டு தெளிவான 28 எஸ் மற்றும் 18 எஸ் பேண்டுகளைக் கொண்டிருக்க வேண்டும், மேலும் முந்தைய பேண்டின் பிரகாசம் பிந்தையதை விட இரண்டு மடங்கு அதிகமாக இருக்க வேண்டும். 5 எஸ் இசைக்குழு ஆர்என்ஏ சிதைந்துவிட்டது என்பதைக் குறிக்கிறது, மேலும் அதன் பிரகாசம் சீரழிவின் அளவிற்கு விகிதாசாரமாகும். அகக் குறிப்பை வெற்றிகரமாகப் பெருக்கினால், ஆர்என்ஏ -வில் எந்தப் பிரச்சினையும் இல்லை என்று அர்த்தம் இல்லை, ஏனெனில் உள் குறிப்பு அதிக அளவில் இருப்பதால், சீரழிவு கடுமையாக இல்லாத வரை ஆர்என்ஏ பெருக்கப்படலாம். OD₂₆₀/OD₂₈₀ஸ்பெக்ட்ரோஃபோட்டோமீட்டரால் அளவிடப்பட்ட தூய ஆர்என்ஏ விகிதம் 1.9 மற்றும் 2.1 க்கு இடையில் இருக்க வேண்டும். ஆர்என்ஏவில் சிறிதளவு புரத கலப்படம் விகிதத்தைக் குறைக்கும். மதிப்பு மிகக் குறைவாக இல்லாத வரை, ஆர்டி பாதிக்கப்படாது. RT க்கு மிகவும் முக்கியமானது RNA ஒருமைப்பாடு.

உள் குறிப்பு மரபணுவின் நீட்டிப்பு ஆர்டி வெற்றி பெற்றதை மட்டுமே குறிக்க முடியும், ஆனால் அது சிடிஎன்ஏ ஸ்ட்ராண்டின் தரத்துடன் தொடர்புடையதாக இல்லை. உள் குறிப்பு துண்டுகள் பொதுவாக அளவில் சிறியதாகவும் வெளிப்பாட்டில் அதிகமாகவும் இருப்பதால், அவை தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் வெற்றி பெறுவது எளிது. இருப்பினும், இலக்கு மரபணுவின் அளவு மற்றும் வெளிப்பாடு மரபணுவிலிருந்து மரபணுவிற்கு மாறுபடும். சிடிஎன்ஏ தரத்தை குறிப்பாக 2 கேபிக்கு மேல் உள்ள இலக்கு துண்டுகளுக்கு உள் குறிப்பு மூலம் மட்டுமே தீர்மானிக்க முடியாது.

சில மாதிரிகள் சிக்கலான இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்புகளைக் கொண்டிருக்கின்றன, அல்லது பணக்கார GC உள்ளடக்கத்தைக் கொண்டிருக்கின்றன அல்லது குறைந்த அளவு கொண்ட விலைமதிப்பற்றவை. இந்த சந்தர்ப்பங்களில், இலக்கு துண்டு மற்றும் மாதிரியின் அளவைப் பொறுத்து பொருத்தமான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் தேர்ந்தெடுக்கப்பட வேண்டும். உயர் ஜிசி உள்ளடக்கம் மற்றும் சிக்கலான இரண்டாம் நிலை அமைப்பு கொண்ட ஆர்என்ஏ வார்ப்புருக்களுக்கு, குறைந்த வெப்பநிலையில் அல்லது பொதுவான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸுடன் இரண்டாம் நிலை கட்டமைப்பைத் திறப்பது கடினம். இந்த வார்ப்புருக்களுக்கு, குவாண்ட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸைத் தேர்ந்தெடுக்கலாம், ஏனெனில் அதன் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறன் M-MLV தொடர் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸை விட சிறப்பாக உள்ளது, இது பல்வேறு ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்களை திறம்பட டிரான்ஸ்கிரிப்ஸ் செய்து அதிகபட்சமாக ஆர்என்ஏவை சிடிஎன்ஏ முதல் ஸ்ட்ராண்டாக மாற்றும். பொதுவான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் கிட்டைப் பயன்படுத்தும் போது, ​​20 μl சிஸ்டம் மொத்த RNA இன் 1 μg டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனை மட்டுமே திறம்பட மாற்ற முடியும். கிட்டின் அதிகபட்ச ஆர்டி திறன் குறித்து கவனம் செலுத்துங்கள். டெம்ப்ளேட் அதிகமாக சேர்க்கப்பட்டால், தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் அதிக அளவில் ஆர்என்ஏவை ஆதரிக்கும். எனவே, அமைப்பின் அதிகபட்ச திறனை மீறாமல் இருப்பது நல்லது.

ஏ -1 ஆர்என்ஏ கடுமையாக தாழ்த்தப்பட்டதா மற்றும் ஆர்டி வெற்றிகரமாக இருந்தால் தீர்மானிக்கவும்

பொதுவாக, உள் குறிப்பு பெருக்கத்தின் தோல்விக்கான காரணம் பெரும்பாலும் தீவிர ஆர்என்ஏ சீரழிவால் ஏற்படுகிறது. மற்றொரு சாத்தியமான காரணம் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் தோல்வி. சிடிஎன்ஏ சிங்கிள் ஸ்ட்ராண்டின் தரத்தை மதிப்பிடுவதற்கு உள் குறிப்பை ஒரு தரமாக பயன்படுத்த முடியாது, ஆனால் ஆர்என்ஏ தரத்தில் எந்த பிரச்சனையும் இல்லை என்றால் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் வெற்றிகரமாக உள்ளதா என்பதை தீர்மானிக்க இது ஒரு தரமாக பயன்படுத்தப்படலாம். தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்பாட்டில் மிக முக்கியமான விஷயம், எதிர்வினை செயல்திறனை மேம்படுத்துவதற்காக ஒரு நிலையான வெப்பநிலை மற்றும் ஒரு நிலையான எதிர்வினை அமைப்பை பராமரிப்பது.

A-2 உள் குறிப்பு மரபணுக்களைப் பெருக்குவதற்கான ப்ரைமர்கள் நம்பகமானவையா மற்றும் PCR இல் பயன்படுத்தப்படும் உலைகளில் ஏதேனும் சிக்கல்கள் உள்ளதா என்பதைத் தீர்மானிக்கவும்.

உறவினர் அளவீட்டுக்கு, ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு முன் ஆர்என்ஏ அளவிடப்பட வேண்டும், இது பல ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் கருவிகளிலும் தேவைப்படுகிறது, எடுத்துக்காட்டாக, ஆர்என்ஏ உள்ளீட்டை 1 μg என அளவிடவும். தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்ட சிடிஎன்ஏ என்பது ஆர்என்ஏ, ஒலிகோ டிடி, என்சைம், டிஎன்டிபி மற்றும் ஒரு சிறிய டிஎன்ஏ எச்சம் உட்பட ஒரு கலவையான தீர்வாக இருப்பதால், சிடிஎன்ஏவை துல்லியமாக அளவிட இயலாது. எனவே, ஆர்என்ஏ அளவீடு அவசியம். தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்திறனைக் கருத்தில் கொண்டு வெவ்வேறு மாதிரிகளில், பெறப்பட்ட சிடிஎன்ஏவின் அளவு ஒரே மாதிரியாக இருக்க வேண்டும், மேலும் அளவு பகுப்பாய்வு மொத்த மரபணுக்களின் அதே அளவில் வெவ்வேறு மரபணுக்களின் வெளிப்பாடு நிலைகளின் ஒப்பீட்டை காட்ட முடியும். ஒப்பீட்டு ஃப்ளோரசன்ஸ் அளவு பிசிஆர் செய்யும் போது, ​​அளவு குறிப்பு சிடிஎன்ஏ தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்குப் பிறகு தேவைப்படாது, ஏனெனில் உள் குறிப்பு மரபணு குறிப்பாக செயல்படலாம்.

இது முக்கியமாக மரபணுக்களுடன் தொடர்புடையது, மற்றும் நீண்ட துண்டு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் பெரும்பாலான மரபணுக்களுக்கு சாத்தியமில்லை. முதலாவதாக, தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனின் செயல்திறன் PCR ஐ விட மிகக் குறைவு. இரண்டாவதாக, GC நிறைந்த பகுதி மற்றும் பல மரபணுக்களின் இரண்டாம் நிலை அமைப்பு தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் PCR இரண்டையும் கட்டுப்படுத்துகிறது. இறுதியாக, PCR இன் நம்பகத்தன்மை மற்றும் பெருக்க செயல்திறன் ஒரே நேரத்தில் உத்தரவாதம் அளிப்பது கடினம். தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் செயல்பாட்டில், குறைந்த நகல் மரபணுக்களுக்கு நீண்ட துண்டைப் பெறுவதற்கு யாரும் உத்தரவாதம் அளிக்க முடியாது, குறிப்பாக ஒலிகோ டிடி பயன்படுத்தி. அதிக GC உடன் 5 'UTR ஐப் பொறுத்தவரை, இது மிகவும் கடினம். ஆகையால், சீரற்ற ப்ரைமர்களைக் கொண்டு டிரான்ஸ்கிரிப்டை மாற்றியமைப்பது, இலக்குத் துண்டில் இயற்கையான பிளவு இடங்களைக் கண்டறிவது, பிரிவுகளால் பெருக்குவது, பின்னர் கட்டுப்பாடு செரிமானம் மற்றும் கட்டுப்பாட்டைச் செய்வது இன்னும் நியாயமான முறையாகும். பொதுவாக, 2 kb ஐ விட பெரிய துண்டுகளை நேரடியாகப் பெருக்குவது கடினம், ஆனால் அதைப் பெறுவது எப்போதும் சாத்தியமில்லை: 1. முதலில், RNA/mRNA இன் ஒருமைப்பாட்டிற்கு உத்தரவாதம் அளிக்கிறது, மற்றும் TRIZOL பிரித்தெடுத்தல் விரும்பப்படுகிறது. 2.M-MLV ஆர்டி-பிசிஆர் கிட் நேரடியாகப் பயன்படுத்தப்படலாம். அனீலிங் நேரத்தை நீட்டிக்கவும் மற்றும் பெருக்க செயல்முறையில் சுழற்சி எண்ணை சரியாக அதிகரிக்கவும். மாற்றாக, கூடு கட்டப்பட்ட PCR ஐப் பயன்படுத்தலாம் அல்லது ஒன்று அல்லது இரண்டு எதிர்வினைகளை முதலில் சரியான நீட்டிக்கப்பட்ட நீக்கம் மற்றும் சாதாரண PCR பெருக்கத்திற்கு முன் நீட்டிப்பு நேரத்தை மேற்கொள்ளலாம், இது துண்டுகளை நீட்டிக்க உதவும். பாலிமரேஸின் நம்பகத்தன்மைக்கு கவனம் செலுத்துங்கள். 3. சிறந்த முடிவுகளைப் பெற PCR இல் நீண்ட தாக் பயன்படுத்தப்படலாம். 4. புரத வெளிப்பாடு பயன்பாட்டிற்கு, அதிக நம்பகத்தன்மை கொண்ட பாலிமரேஸ் பயன்படுத்தப்பட வேண்டும்.

TIANGEN வழங்கும் இரண்டு வகையான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் உள்ளன: Quant/King RTase மற்றும் TIANScript M-MLV. அவற்றுக்கிடையேயான முக்கிய வேறுபாடு வார்ப்புருக்களின் உள்ளீட்டு அளவு. குவாண்ட் ஒரு தனித்துவமான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆகும், இது மோலோனி முரைன் லுகேமியா வைரஸிலிருந்து பெறப்பட்ட பொதுவாக பயன்படுத்தப்படும் M-MLV இலிருந்து வேறுபட்டது. குவாண்ட் என்பது ஒரு புதிய உயர் செயல்திறன் கொண்ட தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் ஆகும். 50 ng-2 μg RNA ஐ அதிக தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் செயல்பாடு மற்றும் அதிக மகசூலுடன் பெருக்க குவாண்ட் பொருத்தமானது. சாதாரண எம்எம்எல்வி அல்லது ஏஎம்வி உடன் ஒப்பிடுகையில், குவாண்டின் மிகப்பெரிய பண்பு என்னவென்றால், அது ஆர்என்ஏ வார்ப்புருக்களுடன் மிகவும் வலுவான தொடர்பைக் கொண்டுள்ளது மற்றும் அதிக வெப்பநிலை நீக்கம் இல்லாமல் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் சிக்கலான வார்ப்புருக்களை மாற்றியமைக்க முடியும். அதிக ஜிசி உள்ளடக்கம் கொண்ட வார்ப்புருக்களுக்கு, தலைகீழ் செயல்திறன் அதிகமாக உள்ளது. இருப்பினும், இந்த தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் RNase H செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது, இது cDNA தயாரிப்பின் நீளத்தை பாதிக்கலாம் (<4.5 kb வார்ப்புருக்களுக்கு ஏற்றது). வழக்கமான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு, TIANScript MMLV தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ் பரிந்துரைக்கப்படுகிறது. இந்த RTase என்பது மிகவும் பலவீனமான RNase H செயல்பாட்டைக் கொண்ட ஒரு மாற்றியமைக்கப்பட்ட நொதியாகும், இது நீண்ட (> 5 kb) cDNA தொகுப்புக்கு ஏற்றது.

சிடிஎன்ஏ தொகுப்பு மற்றும் பெருக்கம் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான குழாய் அட்டையைத் திறக்காமல் ஒரே குழாயில் ஒரு படி தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் பிசிஆர் பெருக்கம் நிறைவடைகிறது, இது மாசுபாட்டைக் குறைக்க உதவுகிறது. பெறப்பட்ட அனைத்து சிடிஎன்ஏ மாதிரிகளும் பெருக்கத்திற்குப் பயன்படுத்தப்படுவதால், உணர்திறன் அதிகமாக உள்ளது, மொத்த ஆர்என்ஏவின் குறைந்தபட்சம் 0.01 பிஜி. வெற்றிகரமான ஒரு-படி RTPCR க்கு, மரபணு-குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்கள் பொதுவாக cDNA தொகுப்பைத் தொடங்கப் பயன்படுகின்றன. இரண்டு-படி முறை, அதாவது தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மற்றும் பிசிஆர் பெருக்கம் இரண்டு படிகளில் மேற்கொள்ளப்படுகிறது. சிடிஎன்ஏவைப் பெறுவதற்கு முதலில் ஆர்என்ஏ டெம்ப்ளேட்டில் இருந்து தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மேற்கொள்ளப்படுகிறது, மேலும் பெறப்பட்ட சிடிஎன்ஏ ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட பிசிஆர் எதிர்வினைகளுக்கு உட்படுத்தப்படுகிறது. சிடிஎன்ஏவின் முதல் ஸ்ட்ராண்டின் தொகுப்பை வழிநடத்த ஓலிகோ (டிடி) அல்லது சீரற்ற ப்ரைமர்களை இரண்டு-படி முறை பயன்படுத்தலாம், மேலும் ஒரு குறிப்பிட்ட மாதிரியிலிருந்து அனைத்து எம்ஆர்என்ஏ தகவல்களையும் மாற்றியமைக்க முடியும்.